Polski
Sześcioetapowa metoda identyfikacji pików widm w chromatografii cieczowej: Co dokładnie czyni pik widmowy pikiem widmowym ?
Utworzono 08.25
**Autor: Oryginał z HAMAG
Każdy, kto pracuje w chromatografii cieczowej, z dużym prawdopodobieństwem spotkał się z tą frustrującą sytuacją: na chromatogramie nagle pojawia się tajemniczy pik, jakby znikąd. Jest on obecny nawet wtedy, gdy nie wstrzykuje się próbki; pozostaje również po wykonaniu ślepej próby. Jego czas retencji nie odpowiada żadnemu znanemu składnikowi, a kształt jest całkowicie nieregularny. Nawet po zmianie fazy ruchomej, przepłukaniu kolumny i rozmontowaniu przewodów nadal nie chce zniknąć. To właśnie „pik widmo”, który wywołuje dreszcze u chromatografów — jak duch nawiedzający system.
Gdy pojawi się pik widma, dane stają się nieważne, raporty są opóźnione, a cała partia próbek może wymagać ponownej analizy. Wiele osób ucieka się do ślepej metody prób i błędów, marnując dużo czasu. Kluczem do rozwiązania problemu pików widma jest logiczne, krok po kroku podejście do rozwiązywania problemów.
Poniższa sześcioetapowa "operacja polowania na duchy" zawęża zakres dochodzenia warstwa po warstwie, od systemu aż do poszczególnych komponentów. Postępując zgodnie z tymi krokami w kolejności, zdecydowana większość pików widmowych może zostać precyzyjnie zlokalizowana.
1. Wstrzyknięcie próbki ślepej | Rozróżnianie pików widmowych "wewnętrznych" i "zewnętrznych"
Najwyższy priorytet: zacznij od zmniejszenia zakresu dochodzenia o połowę
Procedura: Użyj fazy ruchomej zamiast próbki i przeprowadź pełny cykl analizy.
Logika określania • Jeśli piki widmowe pojawiają się również w chromatogramie ślepym: jest to pik widmowy wewnętrzny.
Najpierw skup się na zbadaniu zanieczyszczenia fiolki do wstrzykiwań i uszczelki korka, ponieważ jest to źródło wielu pików widmowych; następnie podejrzewaj fazę ruchomą, kolumnę chromatograficzną i rurki w tej kolejności.
Jeśli chromatogram ślepej próby jest czysty i nie wykazuje nieprawidłowości: oznacza to zewnętrzny pik widmowy, a problem pochodzi z samej próbki lub procesu wstrzykiwania.
Wiele osób ma tendencję do pomijania zanieczyszczenia fiolek do wstrzykiwań i uszczelek kapsli; wymywanie ze starych uszczelek lub niewystarczające czyszczenie fiolek może stale wprowadzać zanieczyszczenia, prowadząc do duchowych pików. Nie demontować od razu i nie płukać różnych elementów; najpierw przeprowadzić analizę ślepą, priorytetowo sprawdzając fiolki i uszczelki kapsli. Zidentyfikować źródło problemu przed podjęciem ukierunkowanych działań, aby uniknąć marnowania wysiłku.
2. Wymiana fazy ruchomej | Badanie głównego podejrzanego
Faza ruchoma jest najczęstszym źródłem pików widmowych (ghost peaks) i dlatego jest głównym podejrzanym.
Procedura: Przygotuj świeżą porcję fazy ruchomej i wykonaj kolejny wstrzyknięcie w celu weryfikacji. Jeśli piki widmowe znikną natychmiast po wymianie, sprawa może zostać w zasadzie zamknięta, ponieważ problem leży w fazie ruchomej. Istnieją trzy
częste przyczyny:
• Niewystarczająca czystość samego odczynnika, co prowadzi do wprowadzenia zanieczyszczeń do układu chromatograficznego;
• Faza ruchoma była przechowywana zbyt długo, co spowodowało utlenianie i pogorszenie jakości rozpuszczalnika;
• Butelki na rozpuszczalnik nie były czyszczone przez długi czas, a zanieczyszczenia przylegają do ścianek butelek i stale uwalniają zanieczyszczenia. Ponadto nieprawidłowe pH fazy ruchomej może również wywoływać nieprawidłowe piki widma. Identyfikując źródło i rozwiązując problem w sposób ukierunkowany, można wyeliminować tego typu piki widma.
3. Płukanie kolumny chromatograficznej | Dokładne czyszczenie "miejsca zdarzenia"
Kolumna chromatograficzna to "miejsce zdarzenia", przez które przepływa zarówno faza ruchoma, jak i próbka, i jest podatna na gromadzenie zanieczyszczeń z próbki.
Procedura: Użyć 90% roztworu izopropanolu i wody, ustawić odpowiednio wysokie natężenie przepływu i przepłukać kolumnę przez co najmniej 30 minut; następnie przełączyć z powrotem na fazę ruchomą analityczną w celu zrównoważenia układu. (Metoda płukania kolumn z odwróconą fazą C18) Tych warunków płukania nie należy stosować do innych typów kolumn; w celu uzyskania instrukcji konserwacji należy zapoznać się z odpowiednią instrukcją kolumny.
Jeśli po płukaniu piki widmowe zostaną znacznie zredukowane, oznacza to, że kolumna została zanieczyszczona.
Wskazówka: W przypadku rutynowej analizy próbek o złożonej matrycy zaleca się regularne wykonywanie płukań konserwacyjnych kolumny; nie należy czekać, aż pojawią się piki widmowe, zanim podejmie się działania naprawcze, ponieważ zapobieganie jest zawsze lepsze niż leczenie.
4. Sprawdzanie systemu wprowadzania próbki | Uważna obserwacja „nośników” próbki
Igła do wstrzykiwań, uchwyt igły, pierścień objętościowy i zawór sześciodrożny tworzą ścieżkę, przez którą próbki dostają się do przyrządu; są to również obszary najbardziej narażone na zanieczyszczenia resztkowe. Po analizie próbek o wysokim stężeniu składniki pozostają uwięzione w szczelinach; podczas następnego wstrzyknięcia są one wymywane, przekształcając się w piki widmowe.
Procedura: Dokładnie przepłukać igłę do wstrzykiwań, uchwyt igły, pierścień objętościowy i zawór sześciodrożny metanolem lub izopropanolem, jednocześnie zastępując roztwór do płukania igły świeżą porcją.
Praktyczna wskazówka: Po analizie próbek o wysokim stężeniu zwiększ częstotliwość i objętość płukania igły, aby dokładnie oczyścić drogę wstrzykiwania i wyeliminować zakłócenia duchów spowodowane pozostałościami po poprzednim wstrzyknięciu.
5. Rozwiązywanie problemów z przewodami segment po segmencie | Zawężanie poszukiwań
Jeśli pik ducha utrzymuje się po poprzednich czterech krokach, należy zastosować metodę lokalizacji przewodów segment po segmencie.
Procedura: Usuń kolumnę chromatograficzną i użyj złączki dwukierunkowej, aby ominąć określony odcinek przewodu poprzez zmianę ścieżki przepływu, co pozwoli ustalić, czy ten odcinek jest zanieczyszczony.
Uwaga: Nie przecinać rurki bezpośrednio, ponieważ dane bazowe uzyskane z niekompletnej ścieżki przepływu nie są wiarygodne. Jeśli duchowy pik zniknie po ominięciu danego odcinka, oznacza to, że zanieczyszczenie znajduje się w tym odcinku rurki. Systematycznie zawężając rozległy, kompletny system HPLC do konkretnego odcinka rurki, nawet najbardziej uporczywe zanieczyszczenie nie będzie miało gdzie się ukryć.
6. Sprawdzanie detektora | Ostateczny podejrzany
Gdy wszystkie poprzednie elementy zostaną wykluczone, musimy zwrócić uwagę na ostatni element — detektor.
Procedura ta składa się z dwóch etapów:
• Oczyść komorę detekcyjną, aby usunąć wszelkie pozostałości zanieczyszczeń z jej wnętrza;
• Sprawdź czas pracy lampy deuterowej oraz energię źródła światła. Starzenie się lampy deuterowej i spadek energii mogą bezpośrednio powodować wahania i dryf linii bazowej; w chromatogramie objawia się to sygnałami zakłóceń przypominającymi piki widma. Potwierdzenie, że lampa deuterowa się zestarzała, i jej szybka wymiana wyeliminuje zakłócenia pików.
Złota zasada rozwiązywania problemów: zmieniaj tylko jedną zmienną na raz! Istnieje jeszcze jedna kluczowa zasada sześcioetapowego procesu rozwiązywania problemów, której nigdy nie należy pomijać: podczas każdej pojedynczej operacji zmieniaj tylko jedną zmienną.
Niezależnie od tego, czy zmieniasz fazę ruchomą, czy płuczesz kolumnę, każdy krok musi być walidowany osobno. W żadnym wypadku nie należy jednocześnie zmieniać fazy ruchomej, płukać kolumny i czyścić igły dozownika. Nawet jeśli piki widmowe znikną, nie będziesz mieć pojęcia, który krok faktycznie rozwiązał problem. Jeśli usterka się powtórzy, będziesz zmuszony ślepo powtórzyć cały zestaw operacji. Kontrolując pojedynczą zmienną, możesz precyzyjnie zlokalizować pierwotną przyczynę usterki, a każda sesja rozwiązywania problemów przyczyni się do Twojego praktycznego doświadczenia.
Contact
Leave your information and we will contact you.
telefon